DOCK 180 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401387-ACT

A DOCK1 (DOCK 180) humana é um fator atípico de troca de nucleotídeos de guanina que ativa GTPases da família Rac para coordenar a remodelação do citoesqueleto de actina, a adesão celular e a migração dirigida. Por meio de nós de sinalização a jusante de integrinas, receptores tirosina-quinase e receptores de quimiocinas, a DOCK 180 sustenta processos como a formação de lamelipódios, a macropinocitose e o engolfamento de células apoptóticas. A sinalização de Rac dependente de DOCK1 interage com vias que regulam transições epitélio–mesênquima, programas de motilidade associados à invasão e o tráfego de células da imunidade inata. A atividade ou expressão desregulada de DOCK1 tem sido associada a fenótipos inflamatórios e a comportamentos relevantes para a disseminação tumoral, tornando-a um alvo útil para estudos mecanísticos em biologia do câncer e imunologia.

DOCK 180 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DOCK1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DOCK 180 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DOCK1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DOCK1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DOCK 180. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DOCK1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DOCK 180 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DOCK 180 em células tumorais com expressão de DOCK1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.