DNA pol θ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-407414-ACT

POLQ codifica la DNA polimerasi theta (DNA pol θ), una polimerasi della famiglia A ad alta propensione all’errore con attività simile a quella di un’elicasi, fondamentale per la giunzione delle estremità mediata da micro-omologie (MMEJ), detta anche giunzione delle estremità mediata dalla polimerasi theta (TMEJ). La DNA pol θ supporta la riparazione delle rotture a doppio filamento e contribuisce alla tolleranza allo stress replicativo, influenzando la stabilità del genoma tramite vie alternative di giunzione delle estremità del DNA che operano quando la NHEJ classica o la ricombinazione omologa sono compromesse. L’attività di POLQ è stata collegata a firme mutazionali e riarrangiamenti cromosomici associati alle risposte al danno del DNA, rendendola rilevante per studi sull’instabilità genomica, sulle lesioni associate alla replicazione e sulla scelta della via di riparazione nelle rotture a doppio filamento. Di conseguenza, POLQ è ampiamente studiato nei meccanismi di riparazione del DNA, nelle interazioni di letalità sintetica e nei modelli di fenotipi di danno al DNA associati a malattia.

DNA pol θ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di POLQ senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DNA pol θ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus POLQ nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione POLQ, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DNA pol θ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus POLQ nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DNA pol θ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DNA pol θ nelle cellule tumorali con espressione di POLQ silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.