Plasmide CRISPR d'Activation (h) DNA pol θ: sc-407414-ACT

POLQ code la polymérase ADN thêta (pol θ), une polymérase de la famille A sujette aux erreurs et dotée d’une activité de type hélicase, qui joue un rôle central dans la jonction d’extrémités médiée par microhomologies (MMEJ), également appelée jonction d’extrémités médiée par la polymérase thêta (TMEJ). La pol θ participe à la réparation des cassures double brin et contribue à la tolérance au stress de réplication, influençant la stabilité du génome via des voies alternatives de jonction des extrémités de l’ADN qui prennent le relais lorsque la NHEJ classique ou la recombinaison homologue est compromise. L’activité de POLQ a été associée à des signatures mutationnelles et à des réarrangements chromosomiques liés aux réponses aux dommages de l’ADN, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude de l’instabilité génomique, des lésions associées à la réplication et du choix de voie lors de la réparation des cassures double brin. En conséquence, POLQ est largement étudié dans les mécanismes de réparation de l’ADN, les interactions de létalité synthétique et les modèles de phénotypes de dommages à l’ADN associés aux maladies.

DNA pol θ Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de POLQ sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DNA pol θ Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus POLQ dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription POLQ, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DNA pol θ. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus POLQ natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DNA pol θ au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DNA pol θ dans les cellules tumorales présentant une expression de POLQ silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.