Plasmide CRISPR d'Activation (h) DNA pol γ: sc-401870-ACT

POLG code pour l’ADN polymérase γ, la principale polymérase réplicative des mitochondries, qui assure la réplication et la réparation de l’ADN mitochondrial (ADNmt) en coordination avec l’hélicase TWNK et la protéine mitochondriale de liaison à l’ADN simple brin. En maintenant le nombre de copies de l’ADNmt et l’intégrité du génome, l’ADN polymérase γ soutient la phosphorylation oxydative, la biogenèse mitochondriale et l’homéostasie des nucléotides. Une altération de la fonction de POLG est associée à une déplétion de l’ADNmt et à l’accumulation de délétions, reliant l’instabilité du génome mitochondrial à des phénotypes de maladies neuromusculaires et neurodégénératives. Comme le dysfonctionnement mitochondrial influence l’apoptose, la signalisation de l’immunité innée et le métabolisme cellulaire, POLG est largement étudié dans les voies qui couplent la bioénergétique aux réponses au stress.

DNA pol γ Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de POLG sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DNA pol γ Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus POLG dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription POLG, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DNA pol γ. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus POLG natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DNA pol γ au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DNA pol γ dans les cellules tumorales présentant une expression de POLG silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.