DNA-PK_CS Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400337-ACT

PRKDC codifica la subunità catalitica della protein-chinasi DNA-dipendente (DNA-PKCS), un regolatore centrale della risposta al danno al DNA che collega il riconoscimento delle estremità del DNA ai processi di riparazione. DNA-PKCS forma l’oloenzima DNA-PK insieme all’eterodimero Ku70/Ku80 per coordinare il non-homologous end joining (NHEJ), promuovendo la riparazione delle rotture a doppio filamento, la ricombinazione V(D)J e il mantenimento della stabilità genomica. Attraverso la fosforilazione di sé stessa e di molteplici fattori di riparazione e di segnalazione, DNA-PKCS si integra con la segnalazione ATM/ATR, le risposte allo stress replicativo e il rimodellamento della cromatina. Un’attività o un’espressione disregolate di PRKDC sono associate a una radiosensibilità alterata, a fenotipi di immunodeficienza e all’instabilità genomica osservata in diversi contesti di ricerca su cancro e neurodegenerazione.

DNA-PKCS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PRKDC senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DNA-PKCS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PRKDC nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PRKDC, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DNA-PKCS. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PRKDC nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DNA-PKCS nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DNA-PKCS nelle cellule tumorali con espressione di PRKDC silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.