Plasmide CRISPR d'Activation (h) DNA Ligase I: sc-402830-ACT

Le gène humain LIG1 code l’ADN ligase I, une ligase dépendante de l’ATP qui scelle les cassures simple brin et relie les fragments d’Okazaki lors de la réplication de l’ADN sur le brin retardé. Cette enzyme est un composant central de la réplication de l’ADN et de multiples voies de réparation de l’ADN, notamment la réparation par excision de base et le traitement des intermédiaires de réparation générés lors de la maintenance du génome. En coordination avec PCNA, FEN1 et d’autres facteurs du replisome et de réparation, l’ADN ligase I favorise la progression de la fourche de réplication et préserve la stabilité chromosomique. La dérégulation des processus liés à LIG1 peut contribuer au stress réplicatif et à des phénotypes d’instabilité génomique fréquemment étudiés en biologie du cancer et dans la recherche sur la réponse aux dommages de l’ADN.

DNA Ligase I Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de LIG1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DNA Ligase I Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus LIG1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription LIG1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DNA Ligase I. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus LIG1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DNA Ligase I au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DNA Ligase I dans les cellules tumorales présentant une expression de LIG1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.