DLD CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403207-ACT

Das humane DLD-Gen kodiert die Dihydrolipoamid-Dehydrogenase, eine FAD-abhängige Oxidoreduktase, die als E3-Untereinheit dient und von den Pyruvatdehydrogenase-, α-Ketoglutaratdehydrogenase- und verzweigtkettigen α-Ketosäuredehydrogenase-Komplexen in den Mitochondrien gemeinsam genutzt wird. Durch die Reoxidation von Dihydrolipoamid und die Übertragung von Elektronen auf NAD+ trägt DLD zur Aufrechterhaltung der Acetyl-CoA-Produktion, des TCA-/Citratzyklus-Flusses und des mitochondrialen Redoxgleichgewichts bei. Diese Aktivität verknüpft den Kohlenhydrat- und Aminosäurekatabolismus mit der oxidativen Phosphorylierung und der Kontrolle reaktiver Sauerstoffspezies. Eine veränderte DLD-Funktion wird mit mitochondrialen Stoffwechselstörungen und neurometabolischen Krankheitsphänotypen in Verbindung gebracht und macht DLD zu einem relevanten Knotenpunkt für Studien zur Energiehomöostase und redoxabhängigen Signalübertragung.

DLD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DLD-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DLD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DLD-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DLD-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DLD-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DLD-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DLD-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DLD-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DLD-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.