Plasmide CRISPR d'Activation (h) dHAND: sc-402017-ACT

HAND2 (dHAND) code un facteur de transcription de type basic helix–loop–helix (bHLH) qui contrôle la spécification des lignages mésenchymateux et la morphogenèse des organes, avec des rôles majeurs dans le développement cardiaque, les dérivés de la crête neurale et la mise en place des membres. dHAND intègre des réseaux de signalisation du développement, notamment BMP, WNT/β-caténine, NOTCH et SHH, afin de réguler des programmes géniques gouvernant la prolifération, la migration et la différenciation. En biologie humaine, une expression altérée de HAND2 ou des dysfonctionnements de sa régulation sont associés à des cardiopathies congénitales et à des anomalies du développement plus larges, et un contrôle transcriptionnel dérégulé a été étudié dans des contextes de remodelage cardiaque et de biologie tumorale. Ces propriétés font de HAND2 un nœud utile pour disséquer les circuits transcriptionnels et les décisions de destinée cellulaire dans des modèles cellulaires et d’organoïdes pertinents.

dHAND Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HAND2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

dHAND Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HAND2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HAND2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de dHAND. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HAND2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de dHAND au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie dHAND dans les cellules tumorales présentant une expression de HAND2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.