Plasmide CRISPR d'Activation (h) desmoplakin I/II: sc-400818-ACT

DSP code la desmoplakine I/II, un cytolieur central des desmosomes qui ancre les filaments intermédiaires aux plaques desmosomales afin de maintenir l’intégrité des tissus épithéliaux et cardiaques sous contrainte mécanique. Par ses interactions avec les desmogléines, les desmocollines, la plakoglobine et les plakophilines, la desmoplakine soutient l’adhésion cellule–cellule, l’organisation du cytosquelette et le remodelage des jonctions lors de la différenciation et de la réépithélialisation associée à la cicatrisation. Une perturbation de l’expression de DSP ou de la stabilité des desmosomes est associée à des défauts de fonction barrière et à une mécanotransduction altérée, en lien avec des phénotypes de cardiomyopathie et de fragilité cutanée. Ces caractéristiques font de DSP une cible pertinente pour étudier la signalisation jonctionnelle, la dynamique des filaments intermédiaires et les voies de réponse au stress qui couplent l’adhésion à l’homéostasie tissulaire.

desmoplakin I/II Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DSP sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

desmoplakin I/II Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DSP dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DSP, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de desmoplakin I/II. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DSP natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de desmoplakin I/II au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie desmoplakin I/II dans les cellules tumorales présentant une expression de DSP silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.