Desmin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400248-ACT

Das humane DES-Gen kodiert Desmin, ein Intermediärfilamentprotein vom Typ III, das in Skelett-, Herz- und glatten Muskelzellen ein zentrales strukturelles Netzwerk bildet. Desminfilamente verbinden Myofibrillen mit dem Sarkolemm, den Mitochondrien und dem Zellkern und tragen so zur mechanischen Stabilität, zur Kraftübertragung sowie zur Positionierung von Organellen während der Kontraktion und bei Stressreaktionen bei. Diese zytoskelettale Architektur ist mit der Organisation der Sarkomere, der Mechanotransduktion und den Proteostase‑Signalwegen verknüpft, die die Integrität des Muskels aufrechterhalten. Eine dysregulierte DES-Expression oder Filamentassemblierung steht mit myofibrillären Myopathien und Kardiomyopathien in Zusammenhang, wodurch Desmin ein wichtiges Ziel für die Erforschung von Muskeldegeneration und stressinduziertem zellulärem Remodeling ist.

Desmin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DES-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Desmin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DES-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DES-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Desmin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DES-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Desmin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Desmin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DES-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.