DEPP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-409806-ACT

C10orf10 kodiert das durch Progesteron induzierte Deziduaprotein (DEPP), einen stressresponsiven Faktor, der unter Hypoxie und Nährstoffmangel induziert wird und mit der Regulation von oxidativem Stress sowie autophagieassoziierten Programmen in Verbindung gebracht wurde. Die DEPP-Expression wurde mit zellulären Anpassungswegen assoziiert, die sich mit metabolischer Signalübertragung und Redox-Homöostase überschneiden, einschließlich der Modulation reaktiver Sauerstoffspezies und des Überlebens unter Bedingungen niedriger Sauerstoffversorgung. Veränderte DEPP-Spiegel wurden in unterschiedlichen Kontexten beschrieben, die Gewebeumbau und Entzündung betreffen, und eine Fehlregulation wurde in Studien zur Tumorbiologie und zu Mechanismen metabolischer Erkrankungen untersucht. Diese Eigenschaften machen DEPP zu einem nützlichen Ziel, um die transkriptionelle Kontrolle der Stressanpassung und nachgeschaltete Phänotypen wie autophagischen Flux, mitochondriale Funktion und Zellviabilität zu untersuchen.

DEPP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen C10orf10-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DEPP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des C10orf10-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der C10orf10-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DEPP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native C10orf10-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DEPP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DEPP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem C10orf10-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.