Plasmide CRISPR d'Activation (h) DEP-1: sc-402501-ACT

PTPRJ code DEP-1, une phosphatase à tyrosine de type récepteur enrichie à la membrane plasmique, où elle contrebalance la signalisation des récepteurs à activité tyrosine kinase. En déphosphorylant des substrats impliqués dans des voies telles que EGFR/ERK et PI3K/AKT, DEP-1 module la prolifération cellulaire, l’adhésion, la migration et le contrôle de la croissance dépendant du contact. L’activité de DEP-1 s’inscrit à l’interface des programmes cytosquelettiques et jonctionnels, influençant la biologie des barrières endothéliales et épithéliales ainsi que les seuils de signalisation des cellules immunitaires. Des altérations de l’expression ou de la fonction de PTPRJ ont été associées à des réseaux de signalisation dérégulés observés dans de multiples contextes cancéreux et phénotypes inflammatoires, ce qui en fait un nœud utile pour des études mécanistiques de l’homéostasie de la phosphotyrosine.

DEP-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PTPRJ sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DEP-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PTPRJ dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PTPRJ, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DEP-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PTPRJ natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DEP-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DEP-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de PTPRJ silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.