DEC2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402891-ACT

BHLHE41 codifica il fattore di trascrizione basic helix-loop-helix DEC2, un regolatore nucleare che si lega ai motivi E-box per modulare le reti trascrizionali circadiane e i programmi di stato cellulare. DEC2 integra segnali provenienti dai componenti centrali dell’orologio biologico e collega l’espressione genica ritmica a processi quali la tempistica sonno–veglia, l’adattamento metabolico e le risposte allo stress cellulare, incluso il rimodellamento trascrizionale associato all’ipossia. In contesti immunitari ed epiteliali, DEC2 è stato collegato alla differenziazione e alla segnalazione infiammatoria, plasmando gli output trascrizionali a valle di stimoli ambientali. Un’attività disregolata di BHLHE41/DEC2 è stata associata in letteratura a fenotipi del sonno alterati e a ruoli dipendenti dal contesto nella biologia tumorale e in modelli di malattie metaboliche, a supporto di studi meccanicistici del controllo trascrizionale.

DEC2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BHLHE41 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DEC2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BHLHE41 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BHLHE41, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DEC2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BHLHE41 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DEC2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DEC2 nelle cellule tumorali con espressione di BHLHE41 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.