Plasmide CRISPR d'Activation (h) DDX15: sc-403959-ACT

DHX15 (DDX15) code une hélicase à ARN de type DEAH, dépendante de l’ATP, qui remodèle les complexes ARN–protéines afin de soutenir l’épissage des pré-ARNm et, plus largement, le métabolisme de l’ARN. Elle participe à la dynamique du spliceosome, notamment à la reconnaissance des introns et aux transitions catalytiques, et a été associée à la coordination entre la transcription et le traitement de l’ARN. En influençant l’utilisation des isoformes de transcrits et le contrôle qualité des ARN, DDX15 peut moduler des programmes d’expression génique qui façonnent la progression du cycle cellulaire et les réponses au stress. Un épissage de l’ARN et une activité d’hélicase dérégulés sont fréquemment associés à la transformation oncogénique ainsi qu’à des phénotypes hématologiques et neurodéveloppementaux, ce qui fait de DHX15 un nœud pertinent pour des études mécanistiques des défauts de traitement de l’ARN.

DDX15 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DHX15 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DDX15 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DHX15 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DHX15, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DDX15. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DHX15 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DDX15 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DDX15 dans les cellules tumorales présentant une expression de DHX15 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.