Plasmide CRISPR d'Activation (m) DDB1: sc-419966-ACT

La DDB1 murine (damage specific DNA binding protein 1) est un adaptateur central du complexe ligase E3 d’ubiquitine CUL4–DDB1, qui coordonne le renouvellement ubiquitine‑dépendant de protéines régulatrices impliquées dans le maintien du génome. Elle participe à la réparation par excision de nucléotides, à l’autorisation (licensing) de la réplication de l’ADN, au remodelage de la chromatine et à la progression du cycle cellulaire, en assemblant des récepteurs de substrats et en modulant la protéostasie après un stress génotoxique. Par ces voies, DDB1 influence les réponses au stress de réplication et les programmes transcriptionnels liés à la prolifération et à la différenciation cellulaires. La dérégulation de la signalisation ubiquitine associée à DDB1 et des circuits de réparation de l’ADN est fréquemment étudiée dans des modèles d’instabilité génomique et de biologie liée au cancer.

DDB1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Ddb1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DDB1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Ddb1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Ddb1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DDB1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Ddb1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DDB1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DDB1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Ddb1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.