Plasmide CRISPR d'Activation (h) dCK: sc-417715-ACT

Le gène humain **DCK** code la désoxycytidine kinase (dCK), une enzyme limitante de la voie de sauvetage des nucléosides qui phosphoryle la désoxycytidine et d’autres désoxynucléosides apparentés en leurs formes monophosphates, contribuant au maintien d’un pool équilibré de dNTP nécessaire à la réplication et à la réparation de l’ADN. L’activité de la dCK relie le métabolisme des nucléotides à la progression du cycle cellulaire, aux réponses au stress réplicatif et au maintien du génome, en particulier dans les tissus prolifératifs. Une expression ou une activité dérégulée de DCK a été associée à une homéostasie des nucléotides altérée et à des vulnérabilités métaboliques observées dans divers contextes de tumeurs hématologiques et solides, et elle est fréquemment étudiée en lien avec la différenciation cellulaire et l’adaptation au stress. En tant que nœud central du métabolisme des nucléosides, DCK constitue une cible utile pour explorer les interactions entre voies avec la fonction mitochondriale, l’état rédox et la signalisation des dommages à l’ADN.

dCK Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DCK sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

dCK Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DCK dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DCK, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de dCK. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DCK natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de dCK au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie dCK dans les cellules tumorales présentant une expression de DCK silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.