Particules Lentivirales d'Activation (h2) DARPP-32: sc-400430-LAC-2

Le gène humain PPP1R1B code DARPP-32 (phosphoprotéine de 32 kDa régulée par la dopamine et l’AMPc), un intégrateur clé de la signalisation dans les neurones épineux moyens, qui relie les entrées dopaminergiques et glutamatergiques à la régulation de la protéine phosphatase-1 (PP1). Lorsqu’elle est phosphorylée de manière dépendante de la PKA, DARPP-32 inhibe PP1 et module ainsi les réseaux de phosphorylation en aval qui contrôlent la plasticité synaptique, l’excitabilité neuronale et les programmes transcriptionnels au sein des voies AMPc/PKA et des récepteurs dopaminergiques, tandis que d’autres états de phosphorylation assurent un couplage à la calcineurine et à d’autres kinases. Des altérations de la signalisation PPP1R1B/DARPP-32 ont été associées à des phénotypes neuropsychiatriques et neurodégénératifs, ainsi qu’à une dérégulation de la signalisation oncogénique dans certains contextes tumoraux, ce qui reflète son rôle étendu dans le contrôle, dépendant de la phosphorylation, de l’état cellulaire. L’édition génétique de PPP1R1B soutient des études mécanistiques de la transduction du signal médiée par la dopamine, de l’équilibre phosphatase/kinase et de l’exploration des voies de signalisation dans des modèles neuronaux et des systèmes cellulaires pertinents pour les maladies.

Les particules d'activation lentivirales DARPP-32 (h2) répondent à ce besoin en encapsulant le système complet d'activation transcriptionnelle SAM (Synergistic Activation Mediator) dans des particules lentivirales à titre élevé prêtes à la transduction, permettant une régulation à la hausse efficace de PPP1R1B dans un plus large éventail de types de cellules humaines.

Les particules d'activation lentivirales DARPP-32 (h2) délivrent tous les composants fonctionnels du système médiateur d'activation synergique (SAM) via la transduction lentivirale. Le système comprend trois préparations de particules co-transduites dans les cellules cibles : l'une codant pour une dCas9 catalytiquement inactive (mutations D10A et N863A) fusionnée au domaine de transactivation VP64 avec un gène de résistance à la blasticidine ; une codant pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1 avec un gène de résistance à l'hygromycine ; et une codant pour un ARNsg de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 avec un gène de résistance à la puromycine. Après transduction lentivirale et intégration génomique des cassettes d'expression, les composants du SAM sont exprimés de manière stable et s'assemblent au locus cible dans la région promotrice proximale en amont du site de départ de la transcription PPP1R1B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de manière coopérative pour recruter l'appareil transcriptionnel endogène et induire une régulation à la hausse soutenue de l'expression endogène de DARPP-32. L'utilisation de dCas9 inactif sur les nucléases évite l'introduction de cassures double brin de l'ADN et préserve le locus génomique natif PPP1R1B ainsi que l'architecture régulatrice.

Le format lentiviral offre plusieurs avantages pratiques : l'intégration génomique stable permet une activation héréditaire au fil des divisions cellulaires ; les préparations de particules à titre élevé éliminent le besoin d'une production virale en interne ; et la compatibilité avec les types de cellules primaires, non divisibles et résistantes à la transfection élargit l'accessibilité expérimentale. Le succès de la transduction peut être confirmé et renforcé par une triple sélection antibiotique utilisant la puromycine, l'hygromycine et la blasticidine.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.