Plasmide CRISPR d'Activation (h) Cytokeratin 6B: sc-401651-ACT

KRT6B code la cytokératine 6B, une protéine de filament intermédiaire de type II qui forme des hétérodimères avec des kératines de type I afin de constituer le cytosquelette de kératine dans les épithéliums stratifiés. La cytokératine 6B contribue à la résistance mécanique, à l’organisation du cytosquelette et aux processus de remodelage épithélial liés à la réparation des plaies et aux réponses au stress, en s’intégrant aux complexes jonctionnels et à des programmes de signalisation qui coordonnent la différenciation et la prolifération. Une expression modifiée de KRT6B est observée dans des états de kératinisation hyperprolifératifs et dans des pathologies épithéliales, et elle est fréquemment utilisée comme marqueur de kératinocytes activés dans la peau et les tissus muqueux. Ces caractéristiques font de KRT6B une cible pertinente pour l’étude de l’homéostasie épithéliale, de la fonction barrière et des modifications du cytosquelette associées à des modèles de maladie.

Cytokeratin 6B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KRT6B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Cytokeratin 6B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KRT6B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KRT6B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Cytokeratin 6B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KRT6B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Cytokeratin 6B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Cytokeratin 6B dans les cellules tumorales présentant une expression de KRT6B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.