cytohesin-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403025-ACT

Il gene umano **CYTH2** codifica la **citosina-2 (cytohesin-2)**, un fattore di scambio di nucleotidi della guanina (GEF) per ARF che attiva le piccole GTPasi ARF per coordinare il traffico di membrana, la segnalazione dipendente dai fosfoinositidi e il rimodellamento del citoscheletro di actina. Attraverso il suo dominio catalitico **Sec7** e il reclutamento alla membrana mediato dal dominio **pleckstrin homology**, la cytohesin-2 supporta il riciclo dei recettori, l’adesione dipendente dalle integrine e vie a valle, tra cui **PI3K/AKT** e **MAPK**, che modellano la motilità cellulare e le risposte di sopravvivenza. L’attività di **CYTH2** è stata studiata in contesti di attivazione delle cellule immunitarie e di segnalazione infiammatoria, e la disregolazione dell’asse **cytohesin/ARF** è spesso analizzata per il suo contributo a migrazione aberrante e alterato controllo della crescita in fenotipi cellulari associati a malattia. Queste proprietà rendono **CYTH2** un bersaglio utile per analizzare la regolazione dell’endocitosi e la plasticità delle reti di segnalazione nella biologia cellulare meccanicistica.

cytohesin-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CYTH2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

cytohesin-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CYTH2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CYTH2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di cytohesin-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CYTH2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da cytohesin-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via cytohesin-2 nelle cellule tumorali con espressione di CYTH2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.