Plasmide CRISPR d'Activation (h) cystatin C: sc-402420-ACT

CST3 code la cystatine C, un inhibiteur sécrété de protéases à cystéine qui freine les cathepsines et d’autres protéases lysosomales/endosomales, contribuant ainsi au maintien du renouvellement de la matrice extracellulaire, du traitement des antigènes et de la protéostasie. En modulant l’activité des protéases dans le système endolysosomal et l’espace péricellulaire, la cystatine C influence la signalisation inflammatoire, la migration cellulaire et le remodelage tissulaire. Une expression altérée de CST3 ou une variation de l’abondance de la cystatine C a été associée à des processus neurodégénératifs, à des pathologies cérébrovasculaires ainsi qu’à la biologie rénale et cardiovasculaire, ce qui en fait un nœud d’intérêt pour étudier l’équilibre protéase–inhibiteur entre tissus. Dans des modèles cellulaires, la perturbation de CST3 peut servir à explorer les voies reliant la fonction lysosomale, les réponses au stress oxydatif et l’activation de l’immunité innée.

cystatin C Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CST3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

cystatin C Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CST3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CST3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de cystatin C. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CST3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de cystatin C au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie cystatin C dans les cellules tumorales présentant une expression de CST3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.