cystatin A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-416374-ACT

Das humane CSTA kodiert Cystatin A, ein intrazelluläres Cystatin vom Typ I, das papainähnliche Cysteinproteasen wie Cathepsin B, H und L hemmt und dadurch Proteolyse, Antigenprozessierung und die barriereassoziierte zelluläre Homöostase moduliert. Durch die Begrenzung der lysosomalen und zytosolischen Proteaseaktivität trägt Cystatin A zur Regulation der Keratinozytendifferenzierung, der epithelialen Integrität und von Stressreaktionen bei, die mit dem Gleichgewicht von Protease und Antiprotease verknüpft sind. Eine dysregulierte CSTA-Expression wurde mit entzündlichen Hauterkrankungen und epithelialem Remodeling in Verbindung gebracht, und veränderte Dynamiken im Cystatin–Cathepsin-System werden häufig in Studien zu Tumorinvasion, Immun-Signalgebung und Umsatz der extrazellulären Matrix untersucht. Daher dient CSTA als nützlicher Knotenpunkt, um proteasekontrollierte Signalwege zu analysieren, die Zelladhäsion, Migration und programmierten Zelltod beeinflussen.

cystatin A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CSTA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

cystatin A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CSTA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CSTA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen cystatin A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CSTA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von cystatin A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des cystatin A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CSTA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.