Plasmide CRISPR d'Activation (m) Cyr61/CCN1: sc-421062-ACT

Cyr61 (CCN1) code une protéine sécrétée, matricellulaire, qui se lie aux intégrines et aux protéoglycanes à héparane sulfate afin de réguler l’adhésion, la migration, la prolifération et la survie cellulaires au sein de la matrice extracellulaire. CYR61/CCN1 participe aux programmes d’angiogenèse et de réparation tissulaire et coordonne la signalisation via les voies FAK (focal adhesion kinase), MAPK/ERK et PI3K/AKT, tout en modulant le remodelage du cytosquelette. Dans des modèles murins, une activité altérée de Cyr61 a été associée à un remodelage tissulaire dysrégulé, à l’inflammation et à des réponses fibrosantes, et cette protéine est fréquemment étudiée dans le contexte de la biologie vasculaire et du dialogue entre stroma et épithélium. Parce que CCN1 intègre des signaux mécaniques et inflammatoires, elle constitue un nœud utile pour étudier la régulation génique induite par le microenvironnement dans le développement et dans des états pertinents pour la maladie.

Cyr61/CCN1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Cyr61 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Cyr61/CCN1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Cyr61 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Cyr61, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Cyr61/CCN1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Cyr61 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Cyr61/CCN1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Cyr61/CCN1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Cyr61 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.