Plasmide CRISPR d'Activation (h) cyclin D2: sc-401236-ACT

CCND2 code la cycline D2, une cycline clé de la phase G1 qui se lie à CDK4/6 et l’active afin de favoriser la phosphorylation des protéines RB et la libération des programmes transcriptionnels E2F nécessaires à l’entrée en phase S. En intégrant des signaux mitogènes issus de voies telles que PI3K–AKT, MAPK/ERK et des réseaux transcriptionnels sensibles aux facteurs de croissance, la cycline D2 contribue à réguler la prolifération, l’engagement dans le cycle cellulaire et l’expansion spécifique de certaines lignées dans de nombreux tissus. Une expression dérégulée de CCND2 ou des variations de son nombre de copies peuvent perturber le contrôle des points de contrôle et les décisions de destinée cellulaire, ce qui la rend pertinente pour l’étude du remodelage oncogénique du cycle cellulaire, des phénotypes de surcroissance développementale et de défauts de différenciation dépendants du contexte. Comme la cycline D2 interfère avec l’activité de CDK4/6 et la signalisation RB–E2F, elle est fréquemment utilisée comme nœud mécanistique pour explorer la transcription dépendante de la prolifération et la reprogrammation métabolique.

cyclin D2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CCND2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

cyclin D2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CCND2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CCND2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de cyclin D2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CCND2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de cyclin D2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie cyclin D2 dans les cellules tumorales présentant une expression de CCND2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.