Plasmide CRISPR d'Activation (h) cyclin A: sc-400119-ACT

CCNA2 code la cycline A, un régulateur central de la progression du cycle cellulaire qui coordonne l’entrée en phase S et la réplication de l’ADN via l’activation de CDK2, et contribue ensuite au contrôle G2/M avec CDK1. La cycline A intègre les signaux des points de contrôle et les réponses au stress réplicatif afin d’assurer l’activation en temps voulu des origines de réplication, la synthèse d’ADN et la stabilité du génome, en s’articulant avec les programmes transcriptionnels dépendants d’E2F et les voies de réponse aux dommages de l’ADN. Une expression dérégulée de CCNA2 est fréquemment associée à une prolifération aberrante, à une instabilité chromosomique et à une altération de la fidélité des points de contrôle, ce qui en fait un marqueur couramment utilisé et un nœud mécanistique majeur dans les études sur le contrôle oncogénique du cycle cellulaire et le stress lié à la réplication.

cyclin A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CCNA2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

cyclin A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CCNA2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CCNA2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de cyclin A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CCNA2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de cyclin A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie cyclin A dans les cellules tumorales présentant une expression de CCNA2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.