Plasmide CRISPR d'Activation (h) cubilin: sc-402129-ACT

Le gène humain **CUBN** code la cubiline, un grand récepteur endocytaire multiligand exprimé de façon marquée dans le tubule proximal rénal et les épithéliums intestinaux. La cubiline coopère avec la mégaline (LRP2) et l’adaptateur amnionless (AMN) pour assurer la capture dépendante des récepteurs et l’adressage lysosomal de nutriments liés à des protéines, notamment les complexes facteur intrinsèque–vitamine B12 et des protéines plasmatiques filtrées telles que l’albumine. Par ces voies endocytaires, la cubiline contribue au maintien de l’homéostasie des nutriments et régule la réabsorption tubulaire des protéines, reliant ainsi sa fonction au transport épithélial et aux réseaux d’internalisation médiée par des vésicules. Une altération ou une dérégulation de **CUBN** est associée à une diminution de l’absorption de la vitamine B12 et à des anomalies de la prise en charge tubulaire des protéines rénales, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques en biologie des maladies rénales et gastro-intestinales.

cubilin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CUBN sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

cubilin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CUBN dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CUBN, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de cubilin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CUBN natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de cubilin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie cubilin dans les cellules tumorales présentant une expression de CUBN silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.