Plasmide CRISPR d'Activation (m2) CTDSPL2: sc-435953-ACT-2

Le gène murin Ctdspl2 code la protéine CTDSPL2, une phosphatase dépendante du Mg2+ de la famille des déshalogénases des haloacides (HAD), qui contribue à la déphosphorylation de résidus phospho-sérine/thréonine et au contrôle transcriptionnel en régulant la dynamique de phosphorylation du domaine C-terminal de l’ARN polymérase II. CTDSPL2 est impliquée dans les transitions d’état cellulaire en modulant une signalisation dépendante de la phosphorylation et des programmes d’expression génique qui influencent la progression du cycle cellulaire, la différenciation et l’engagement de lignée, en s’intégrant aux voies qui régissent la régulation transcriptionnelle associée à la chromatine. Un dérèglement de l’activité des phosphatases du CTD et des circuits transcriptionnels connexes a été associé à des phénotypes oncogéniques et du développement, faisant de Ctdspl2 un locus utile pour disséquer les réseaux transcriptionnels pilotés par la phosphorylation dans des modèles de maladie. L’édition du gène Ctdspl2 dans des cellules de souris soutient des études de génomique fonctionnelle portant sur le contrôle de la phosphorylation du CTD, les relations phosphatase-substrat et les changements transcriptomiques en aval pertinents dans des contextes de prolifération et de différenciation.

CTDSPL2 Le plasmide d'activation CRISPR (m2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Ctdspl2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CTDSPL2 Le plasmide d'activation CRISPR (m2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Ctdspl2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Ctdspl2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CTDSPL2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Ctdspl2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CTDSPL2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CTDSPL2 dans les cellules tumorales présentant une expression de Ctdspl2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.