Plasmide CRISPR d'Activation (h) CstF-64: sc-402202-ACT

CSTF2 code pour CstF-64, une sous-unité liant l’ARN du complexe « cleavage stimulation factor », qui reconnaît des éléments de séquence riches en GU/U situés en aval afin de favoriser le clivage de l’extrémité 3′ du pré-ARNm et la polyadénylation. En contrôlant le choix de sites alternatifs de polyadénylation, CstF-64 module la longueur de la 3′ UTR, la stabilité des ARNm, l’efficacité de traduction et la localisation des transcrits, ce qui le relie à la régulation globale de l’expression génique au cours de la prolifération et de la différenciation. La polyadénylation dépendante de CSTF2 s’articule avec la terminaison de la transcription et les voies de maturation de l’ARN, influençant la diversité des isoformes et les réseaux de régulation post-transcriptionnelle. La dérégulation de la polyadénylation alternative et de la maturation de l’extrémité 3′ est associée à des altérations de programmes géniques oncogéniques et développementaux, faisant de CSTF2 une cible pertinente pour des études mécanistiques sur la maturation des ARN et le remodelage du transcriptome associé aux maladies.

CstF-64 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CSTF2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CstF-64 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CSTF2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CSTF2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CstF-64. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CSTF2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CstF-64 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CstF-64 dans les cellules tumorales présentant une expression de CSTF2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.