Plasmide CRISPR d'Activation (h) CSP: sc-403622-ACT

L’ADNJC5 humain code la cysteine string protein (CSP), un co-chaperon présynaptique qui agit en partenariat avec HSC70 et d’autres facteurs de protéostasie pour maintenir le cycle des vésicules synaptiques et la libération des neurotransmetteurs. La CSP favorise le repliement et la stabilité des composants de la machinerie SNARE/exocytose et contribue à protéger les terminaisons nerveuses du stress dépendant de l’activité grâce à un contrôle qualité médié par des chaperons. En régulant le trafic vésiculaire et les voies de maintenance synaptique, DNAJC5 est largement pertinente pour l’étude de l’homéostasie neuronale et de la gestion des protéines à la synapse. Une altération de la fonction de la CSP est associée à des phénotypes neurodégénératifs caractérisés par une dysfonction synaptique et une perturbation du renouvellement protéique, ce qui fait de ce gène un outil utile pour des modèles mécanistiques de vulnérabilité neuronale.

CSP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DNAJC5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CSP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DNAJC5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DNAJC5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CSP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DNAJC5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CSP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CSP dans les cellules tumorales présentant une expression de DNAJC5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.