Plasmide CRISPR d'Activation (h) CSA: sc-403428-ACT

ERCC8 code la protéine A du syndrome de Cockayne (CSA), un facteur à répétitions WD40 qui constitue la sous-unité de reconnaissance du substrat du complexe ligase E3 d’ubiquitine CRL4^CSA. CSA est un élément central de la réparation par excision de nucléotides couplée à la transcription : elle coordonne la reconnaissance des lésions au niveau de l’ARN polymérase II bloquée et favorise, via l’ubiquitination, le remodelage des machineries de réparation et de transcription afin de rétablir l’expression génique après des dommages induits par les UV. Par ses interactions avec CSB/ERCC6 et d’autres facteurs de la NER, CSA contribue au maintien de la stabilité du génome et soutient la reprise de la transcription après un stress génotoxique. Des variants pathogènes d’ERCC8 sont associés au syndrome de Cockayne et à des phénotypes apparentés de photosensibilité aux UV, d’atteintes neurodéveloppementales et de vieillissement prématuré, ce qui fait de la régulation de CSA un enjeu pertinent pour l’étude de la capacité de réparation de l’ADN et de la signalisation des réponses au stress.

CSA Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ERCC8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CSA Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ERCC8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ERCC8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CSA. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ERCC8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CSA au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CSA dans les cellules tumorales présentant une expression de ERCC8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.