Plasmide CRISPR d'Activation (h) Crk-L: sc-401097-ACT

CRKL code pour Crk‑L, une protéine adaptatrice SH2/SH3 qui couple les tyrosine kinases activées, réceptrices ou non réceptrices, à des complexes de signalisation en aval contrôlant l’adhérence, la migration, la prolifération et la survie cellulaires. Crk‑L participe à des voies dépendantes des intégrines et des facteurs de croissance, notamment la dynamique des adhésions focales ainsi que les voies Ras/MAPK et PI3K, en reliant des protéines d’ancrage phosphorylées à des modules effecteurs. Il s’agit d’un nœud bien caractérisé de la signalisation des kinases de la famille ABL, fréquemment étudié dans des contextes de réseaux de phosphorylation sur tyrosine altérés. Une dérégulation de l’expression de CRKL ou de sa connectivité de signalisation est associée à une motilité cellulaire aberrante et à l’activation de voies oncogéniques, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques de la transformation et des phénotypes invasifs.

Crk-L Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CRKL sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Crk-L Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CRKL dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CRKL, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Crk-L. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CRKL natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Crk-L au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Crk-L dans les cellules tumorales présentant une expression de CRKL silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.