Plasmide CRISPR d'Activation (h) Cripto: sc-417492-ACT

Le TDGF1 humain code Cripto (également appelé CRIPTO-1), un co-récepteur ancré à la membrane par un GPI qui module l’organisation embryonnaire et les décisions de destin cellulaire en ajustant la signalisation de la famille TGF-β. Cripto facilite la signalisation NODAL/ALK4/7 et s’articule avec des voies telles que SMAD2/3, WNT/β-caténine et PI3K–AKT pour réguler la transition épithélio-mésenchymateuse, la migration et des phénotypes de type cellule souche. Une expression dérégulée de TDGF1 est fréquemment associée à des programmes de développement altérés dans des états cellulaires pertinents pour la maladie, notamment la signalisation proliférative, l’invasivité et le blocage de la différenciation. Ces propriétés font de Cripto un outil moléculaire utile pour étudier le remodelage des voies de signalisation du développement et les interactions entre voies oncogéniques dans des systèmes modèles humains.

Cripto Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TDGF1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Cripto Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TDGF1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TDGF1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Cripto. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TDGF1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Cripto au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Cripto dans les cellules tumorales présentant une expression de TDGF1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.