Plasmide CRISPR d'Activation (h) CRF-RI: sc-400730-ACT

CRHR1 code le récepteur 1 du facteur de libération de la corticotropine (CRF-R1), un RCPG de classe B qui se lie à la CRH et aux urocortines pour réguler les voies de signalisation cellulaire liées au stress. Après activation, CRF-R1 se couple principalement à Gs pour stimuler l’adénylate cyclase, augmenter l’AMPc et engager des programmes transcriptionnels dépendants de PKA/CREB, avec, selon le contexte, un couplage additionnel aux voies MAPK/ERK et à des voies associées au calcium. La signalisation médiée par CRHR1 module les réponses neuroendocriniennes via l’axe HHS (HPA) et influence l’excitabilité neuronale, la plasticité synaptique et le dialogue croisé avec l’inflammation. Une activité et des profils d’expression dérégulés de CRHR1 ont été impliqués dans des phénotypes neuropsychiatriques liés au stress et dans des dysfonctionnements neuroendocriniens plus larges, ce qui en fait une cible utile pour disséquer l’architecture des voies de signalisation dans des modèles cellulaires humains pertinents.

CRF-RI Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CRHR1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CRF-RI Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CRHR1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CRHR1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CRF-RI. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CRHR1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CRF-RI au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CRF-RI dans les cellules tumorales présentant une expression de CRHR1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.