Plasmide CRISPR d'Activation (h) CREST: sc-403134-ACT

SS18L1 (CREST) code un facteur associé à la chromatine, enrichi dans les neurones, qui intervient dans la régulation transcriptionnelle et les programmes d’expression génique dépendants de l’activité. CREST coopère avec les machineries de remodelage de la chromatine, notamment des complexes apparentés à SWI/SNF, pour moduler l’état des promoteurs et des enhancers, influençant la différenciation neuronale, la croissance des neurites et la fonction synaptique. Par ces mécanismes épigénétiques, SS18L1 relie la signalisation neuronale à des changements durables des réseaux transcriptionnels et de l’identité cellulaire. La dérégulation des voies associées à CREST a été étudiée dans le cadre de processus pertinents pour les maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives, notamment l’altération de l’homéostasie synaptique et la transcription induite par le stress.

CREST Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SS18L1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CREST Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SS18L1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SS18L1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CREST. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SS18L1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CREST au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CREST dans les cellules tumorales présentant une expression de SS18L1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.