CPTII CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403401-ACT

Das humane **CPT2**-Gen kodiert die Carnitin-Palmitoyltransferase II (CPTII), ein Enzym der inneren Mitochondrienmembran, das die Rückumwandlung langkettiger Acylcarnitine zu Acyl‑CoA katalysiert und damit den Eintritt in die β‑Oxidationsspirale ermöglicht. Dieser Schritt ist essenziell für die mitochondriale Fettsäureoxidation und die Energiehomöostase in Geweben mit hohem Energiebedarf und verknüpft die CPTII-Aktivität mit Ketogenese, ATP-Produktion und metabolischen Stressantworten. Eine veränderte CPT2-Funktion stört die Verwertung langkettiger Fettsäuren und ist mit angeborenen Stoffwechselstörungen assoziiert, die durch eine beeinträchtigte Fettsäureoxidation gekennzeichnet sind – insbesondere bei Fasten, Krankheit oder erhöhtem Energiebedarf. CPT2 wird daher breit in Signalwegen untersucht, die den mitochondrialen Stoffwechsel, den Lipidumsatz und die zelluläre Bioenergetik steuern.

CPTII Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CPT2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CPTII Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CPT2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CPT2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CPTII-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CPT2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CPTII-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CPTII-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CPT2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.