Plasmide CRISPR d'Activation (h) CPSF4: sc-403190-ACT

Le CPSF4 humain (cleavage and polyadenylation specificity factor, sous-unité 4) est un composant essentiel du complexe CPSF, qui reconnaît le signal de polyadénylation AAUAAA et coordonne le clivage de l’extrémité 3′ ainsi que l’ajout de la queue poly(A) sur les pré-ARNm. En couplant la terminaison de la transcription à la maturation des ARNm, CPSF4 contribue à façonner la stabilité des transcrits, leur export nucléaire et l’efficacité de traduction, reliant ainsi le traitement de l’ARN au contrôle global de l’expression génique. Une perturbation de la polyadénylation dépendante de CPSF4 peut modifier l’utilisation des sites alternatifs de poly(A) et altérer l’équilibre des isoformes, avec des effets en aval sur les programmes du cycle cellulaire, les réponses au stress et la différenciation. Des paysages de maturation de l’extrémité 3′ et de polyadénylation dérégulés constituent des caractéristiques récurrentes du cancer et d’autres troubles prolifératifs ou associés au métabolisme de l’ARN, faisant de CPSF4 un nœud d’intérêt pour des études mécanistiques des phénotypes induits par le traitement de l’ARN.

CPSF4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CPSF4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CPSF4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CPSF4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CPSF4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CPSF4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CPSF4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CPSF4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CPSF4 dans les cellules tumorales présentant une expression de CPSF4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.