Plasmide CRISPR d'Activation (m) copine 8: sc-426239-ACT

Le gène murin Cpne8 code la copine 8, une protéine de liaison aux phospholipides dépendante du calcium, contenant des domaines C2 et un domaine A qui permet une association régulée à la membrane. Les membres de la famille des copines sont impliqués dans des événements de signalisation déclenchés par le calcium à la membrane plasmique et dans les compartiments endomembranaires, en influençant le trafic vésiculaire, le remodelage membranaire et la dynamique de recrutement des protéines. En couplant les flux de Ca2+ à des interactions protéiques à proximité de la membrane, la copine 8 intervient dans des voies qui modulent le renouvellement des récepteurs et l’amplitude de la signalisation intracellulaire. Une régulation altérée des réseaux du calcium et du trafic membranaire est fréquemment étudiée dans des contextes tels que la communication neuronale, la signalisation immunitaire et les réponses au stress, ce qui fait de Cpne8 une cible utile pour l’exploration mécanistique des voies.

copine 8 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Cpne8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

copine 8 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Cpne8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Cpne8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de copine 8. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Cpne8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de copine 8 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie copine 8 dans les cellules tumorales présentant une expression de Cpne8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.