Plasmide CRISPR d'Activation (h) COP1: sc-402776-ACT

RFWD2 code pour COP1, une ligase E3 ubiquitine de type RING qui régule la stabilité des protéines en catalysant leur ubiquitination et leur dégradation par le protéasome pour de multiples régulateurs de la signalisation et de la transcription. COP1 influence des programmes cellulaires, notamment les réponses aux dommages de l’ADN, la progression du cycle cellulaire et la transcription adaptative au stress, en modulant l’abondance et l’activité des effecteurs de voie. Par son contrôle de la protéostasie dépendante de l’ubiquitine, COP1 peut remodeler des réseaux transcriptionnels pertinents pour la signalisation oncogénique, la différenciation et l’homéostasie cellulaire. Une expression ou une activité dérégulée de COP1 a été associée à une modification de l’équilibre entre suppresseurs de tumeurs et oncogènes, ce qui fait de RFWD2 un nœud utile pour des études mécanistiques de la biologie des maladies liées à la voie de l’ubiquitine.

COP1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RFWD2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

COP1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RFWD2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RFWD2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de COP1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RFWD2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de COP1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie COP1 dans les cellules tumorales présentant une expression de RFWD2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.