Plasmide CRISPR d'Activation (h) connexin 50: sc-404332-ACT

GJA8 code la connexine 50 (Cx50), une protéine des jonctions communicantes (gap junctions) qui s’oligomérise en connexons et forme des canaux intercellulaires permettant l’échange direct d’ions et de petits métabolites. Dans le cristallin, le couplage médié par Cx50 contribue à l’homéostasie de ce tissu avasculaire, à la différenciation des cellules fibres et au maintien de la transparence du cristallin grâce à une signalisation coordonnée et à un partage métabolique. La connexine 50 participe également à des processus de communication cellule–cellule qui influencent la prolifération et la différenciation via la régulation, au niveau des jonctions, des seconds messagers intracellulaires. Des altérations de l’expression de GJA8 ou des propriétés de ses canaux ont été associées à des affections héréditaires du cristallin, notamment les cataractes congénitales et la microphtalmie, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques du développement du cristallin et de la protéostasie.

connexin 50 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GJA8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

connexin 50 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GJA8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GJA8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de connexin 50. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GJA8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de connexin 50 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie connexin 50 dans les cellules tumorales présentant une expression de GJA8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.