connexin 46 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403947-ACT

GJA3 kodiert Connexin 46, ein in der Linse angereichertes Gap-Junction-Protein, das sich zu Hemikanälen und interzellulären Kanälen zusammensetzt und so den direkten Zell‑Zell‑Austausch von Ionen und Metaboliten ermöglicht. Durch die Unterstützung der Kopplung von Linsenfaserzellen trägt Connexin 46 zur Aufrechterhaltung der Ionenhomöostase, des Redoxgleichgewichts und der metabolischen Koordination bei, die für die Transparenz der Linse erforderlich sind. Eine veränderte Connexin‑46‑Funktion stört die Gap‑Junction‑Kommunikation und ist mit hereditären Katarakt‑Phänotypen sowie einer beeinträchtigten Linsenphysiologie assoziiert. In Zellmodellen wird die GJA3‑Aktivität häufig im Zusammenhang mit Membrantransport, Kanal‑Gating und stressresponsiven Signalwegen untersucht, die die Proteostase und oxidative Schäden beeinflussen.

connexin 46 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GJA3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

connexin 46 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GJA3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GJA3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen connexin 46-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GJA3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von connexin 46-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des connexin 46-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GJA3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.