connexin 36 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402740-ACT

GJD2 kodiert Connexin 36 (Cx36), ein Gap-Junction-Protein, das sich zu interzellulären Kanälen zusammenlagert und so eine direkte elektrische und metabolische Kopplung zwischen benachbarten Zellen ermöglicht. Die durch Cx36 vermittelte Kopplung unterstützt synchronisiertes Feuern und Netzwerkoszillationen, insbesondere in neuronalen Schaltkreisen, indem sie einen schnellen Ionenfluss und den Austausch kleiner Moleküle über die Membranen erlaubt. Im zentralen Nervensystem und anderen erregbaren Geweben beeinflusst Connexin 36 die synaptische Integration, die Signalausbreitung und aktivitätsabhängige Plastizität durch die Regulation des Aufbaus und der Steuerung (Gating) von Gap Junctions. Eine veränderte Expression von GJD2/Connexin 36 oder eine veränderte Kopplung wurde mit neurophysiologischen Funktionsstörungen in Verbindung gebracht und wird im Kontext von Erkrankungen untersucht, bei denen die neuronale Synchronität beeinträchtigt ist.

connexin 36 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GJD2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

connexin 36 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GJD2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GJD2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen connexin 36-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GJD2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von connexin 36-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des connexin 36-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GJD2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.