Plásmido CRISPR de Activación (h) connexin 26: sc-402132-ACT

GJB2 codifica la conexina 26, una proteína transmembrana de cuatro pasos de las uniones gap que se ensambla en hemicanales hexaméricos y canales intercelulares para mediar la transferencia directa de iones y pequeños metabolitos entre células. La conexina 26 contribuye a la homeostasis de los tejidos epiteliales y sensoriales coordinando el acoplamiento eléctrico, la señalización por calcio y la sincronización metabólica, con funciones adicionales en la liberación de ATP y la comunicación paracrina a través de hemicanales en contextos fisiológicos específicos. Esta proteína es central en las redes de comunicación mediadas por uniones gap que influyen en la diferenciación, la función de barrera y las respuestas al estrés. La variación genética en GJB2 se asocia fuertemente con la pérdida auditiva hereditaria y también se vincula a trastornos sindrómicos que afectan la piel y los tejidos anexos, por lo que es un gen ampliamente estudiado en biología auditiva y fisiología epitelial.

connexin 26 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de GJB2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

connexin 26 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus GJB2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional GJB2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de connexin 26. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo GJB2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de connexin 26 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía connexin 26 en células tumorales con expresión de GJB2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.