Plasmide CRISPR d'Activation (h) connexin 26: sc-402132-ACT

GJB2 code la connexine 26, une protéine transmembranaire à quatre passages des jonctions communicantes (gap junctions) qui s’assemble en hémicanaux hexamériques et en canaux intercellulaires afin de permettre le transfert direct, de cellule à cellule, d’ions et de petits métabolites. La connexine 26 contribue à l’homéostasie des tissus épithéliaux et sensoriels en coordonnant le couplage électrique, la signalisation calcique et la synchronisation métabolique, avec en plus des rôles dans la libération d’ATP et la communication paracrine via des hémicanaux dans des contextes physiologiques spécifiques. Cette protéine est au cœur des réseaux de communication par jonctions communicantes qui influencent la différenciation, la fonction de barrière et les réponses au stress. Les variations génétiques de GJB2 sont fortement associées à la surdité héréditaire et sont également liées à des troubles syndromiques touchant la peau et ses annexes, ce qui en fait un gène largement étudié en biologie de l’audition et en physiologie épithéliale.

connexin 26 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GJB2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

connexin 26 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GJB2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GJB2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de connexin 26. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GJB2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de connexin 26 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie connexin 26 dans les cellules tumorales présentant une expression de GJB2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.