Plasmide CRISPR d'Activation (h) COL2A1: sc-400359-ACT

COL2A1 code la chaîne α1 du collagène de type II, un composant fibrillaire majeur de la matrice extracellulaire du cartilage, qui contribue à la résistance à la traction et à l’hydratation du tissu via des interactions avec les protéoglycanes. Son expression est étroitement liée à la différenciation des chondrocytes et aux programmes d’assemblage de la matrice coordonnés par des réseaux transcriptionnels pilotés par SOX9 ainsi que par des voies de remodelage de la matrice extracellulaire. Une perturbation de COL2A1 altère l’intégrité structurelle du cartilage et peut dérégler des processus de développement endochondral pertinents pour la biologie du squelette et des articulations. Des variations génétiques ou une expression dérégulée de COL2A1 ont été associées à des dysplasies héréditaires du cartilage et du squelette, ce qui en fait une cible fréquente pour l’étude de l’homéostasie de la matrice extracellulaire et de la régulation de la lignée chondrocytaire.

COL2A1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de COL2A1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

COL2A1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus COL2A1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription COL2A1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de COL2A1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus COL2A1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de COL2A1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie COL2A1 dans les cellules tumorales présentant une expression de COL2A1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.