Plásmido CRISPR de Activación (h) claudin-8: sc-404251-ACT

CLDN8 codifica la claudina-8, una proteína tetraspan de las uniones estrechas que regula la permeabilidad paracelular y la integridad de la barrera epitelial. La claudina-8 contribuye a la organización del complejo de uniones apicales y al sellado selectivo de iones en epitelios polarizados, integrándose con vías que controlan la polaridad celular, la adhesión y el transporte transepitelial. La alteración de la expresión de CLDN8 o de su localización en las uniones se asocia con disfunción epitelial y procesos de remodelación observados en trastornos inflamatorios y en cambios de las propiedades de la barrera relacionados con el cáncer. Como componente de las uniones, la claudina-8 se utiliza ampliamente como marcador y como punto de entrada mecanístico para estudiar la diferenciación epitelial y la regulación de la permeabilidad específica de cada tejido.

claudin-8 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CLDN8 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

claudin-8 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CLDN8 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CLDN8, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de claudin-8. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CLDN8 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de claudin-8 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía claudin-8 en células tumorales con expresión de CLDN8 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.