Clathrin Heavy Chain/CLTC CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400863-ACT

CLTC kodiert die Clathrin-Schwerkette, eine zentrale strukturelle Komponente clathrinbeschichteter Gruben (coated pits) und Vesikel, die während der clathrinvermittelten Endozytose die Membrankrümmung und die Auswahl der Fracht koordiniert. Über Interaktionen mit Adapterprotein-Komplexen und akzessorischen Faktoren reguliert CLTC die Internalisierung von Rezeptoren, das Recycling synaptischer Vesikel, den endosomalen Transport sowie den Transport im trans-Golgi-Netzwerk und beeinflusst damit nachgeschaltete Signalwege und die Nährstoffaufnahme. Dieser Signalweg wirkt auf die Homöostase von Rezeptor-Tyrosinkinasen, GPCRs und Immunrezeptoren ein und verknüpft die CLTC-Aktivität mit proliferations- und stressantwortbezogenen Signalnetzwerken. Genetische Veränderungen und eine dysregulierte clathrinabhängige Transportmaschinerie wurden mit neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen sowie mit malignitätsassoziierten Rearrangements unter Beteiligung von CLTC in Verbindung gebracht und stützen mechanistische Untersuchungen von Vesikeltransportdefekten in Krankheitsmodellen.

Clathrin Heavy Chain/CLTC Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CLTC-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Clathrin Heavy Chain/CLTC Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CLTC-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CLTC-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Clathrin Heavy Chain/CLTC-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CLTC-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Clathrin Heavy Chain/CLTC-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Clathrin Heavy Chain/CLTC-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CLTC-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.