Plasmide CRISPR d'Activation (h) CHMP4B: sc-401802-ACT

CHMP4B humain code un composant central du complexe ESCRT-III, qui polymérise sur les membranes endosomales afin d’induire la constriction et la scission membranaires lors de la biogenèse des corps multivésiculaires. Via le trafic dépendant d’ESCRT, CHMP4B contribue à réguler la diminution de l’expression des récepteurs, leur adressage lysosomal et le renouvellement des complexes de signalisation, influençant ainsi des voies liées à la signalisation des facteurs de croissance et à l’homéostasie cellulaire. L’activité d’ESCRT-III soutient également les étapes tardives de l’abscission cytokinétique et participe à la reformation de l’enveloppe nucléaire ainsi qu’à la réparation de la membrane plasmique. La dérégulation des composants d’ESCRT, dont CHMP4B, a été associée à une dynamique endolysosomale altérée et présente un intérêt pour la recherche sur la neurodégénérescence, la signalisation des cellules cancéreuses et les mécanismes de bourgeonnement viral.

CHMP4B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CHMP4B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CHMP4B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CHMP4B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CHMP4B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CHMP4B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CHMP4B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CHMP4B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CHMP4B dans les cellules tumorales présentant une expression de CHMP4B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.