Plasmide CRISPR d'Activation (h) CHMP4A: sc-402539-ACT

Le gène humain **CHMP4A** code un composant central de la machinerie **ESCRT-III**, qui remodèle les membranes afin de favoriser la formation de vésicules intraluminales lors de la biogenèse des corps multivésiculaires et du tri du cargo endosomal. CHMP4A participe également à l’abscission cytokinétique et contribue à coordonner des événements de scission membranaire importants pour la réparation de la membrane plasmique et la diminution de l’expression des récepteurs. Par ces fonctions, CHMP4A influence la protéostasie et l’atténuation des voies de signalisation, notamment via le contrôle, dépendant du trafic intracellulaire, des réponses des récepteurs aux facteurs de croissance. Un dysfonctionnement d’ESCRT est largement associé à la signalisation oncogénique, à des processus neurodégénératifs et à une sensibilité accrue aux agents pathogènes qui détournent le bourgeonnement dépendant d’ESCRT, ce qui fait de CHMP4A un nœud pertinent pour des études mécanistiques du remodelage membranaire.

CHMP4A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CHMP4A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CHMP4A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CHMP4A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CHMP4A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CHMP4A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CHMP4A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CHMP4A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CHMP4A dans les cellules tumorales présentant une expression de CHMP4A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.