Plasmide CRISPR d'Activation (h) CH25H: sc-402849-ACT

CH25H humain code la cholestérol 25-hydroxylase, une enzyme associée au réticulum endoplasmique qui convertit le cholestérol en 25‑hydroxycholestérol, un oxystérol modulant l’homéostasie des stérols et la signalisation de l’immunité innée. L’activité de CH25H s’articule avec les programmes de biosynthèse et de transport du cholestérol, notamment la régulation métabolique pilotée par SREBP, et influence en aval le contrôle, médié par les lipides, de l’expression des gènes inflammatoires. En tant que facteur inductible par les interférons dans des contextes myéloïdes et épithéliaux, CH25H a été associé aux interactions hôte–pathogène et à la régulation des réponses cytokiniques. Une signalisation CH25H/25‑hydroxycholestérol dérégulée est pertinente pour l’étude de l’inflammation métabolique, des voies associées à l’athérosclérose et des perturbations immunitaires observées lors d’infections et de phénotypes de type auto-immun.

CH25H Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CH25H sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CH25H Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CH25H dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CH25H, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CH25H. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CH25H natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CH25H au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CH25H dans les cellules tumorales présentant une expression de CH25H silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.