Plasmide CRISPR d'Activation (h) CDKN3: sc-403243-ACT

CDKN3 (cyclin-dependent kinase inhibitor 3) code une phosphatase à double spécificité qui module la progression du cycle cellulaire en déphosphorylant les kinases dépendantes des cyclines, avec des rôles marqués dans le contrôle de l’activité de CDK1/CDC2 lors de la transition G2/M. En régulant des points de contrôle dépendants de la phosphorylation, CDKN3 influence l’entrée en mitose, le rythme de prolifération et les programmes de stabilité du génome liés aux réponses aux dommages de l’ADN. Une expression dérégulée de CDKN3 a été associée à une altération du contrôle du cycle cellulaire dans de multiples contextes cancéreux, ce qui en fait un nœud moléculaire utile pour étudier la signalisation proliférative et l’adaptation des points de contrôle. Dans les cellules humaines, la perturbation des niveaux de CDKN3 peut aider à disséquer comment l’ajustement des CDK médié par des phosphatases façonne la fidélité de la mitose et les états transcriptionnels sensibles au stress.

CDKN3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CDKN3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CDKN3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CDKN3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CDKN3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CDKN3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CDKN3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CDKN3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CDKN3 dans les cellules tumorales présentant une expression de CDKN3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.