CDD CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403915-ACT

Das humane CDA-Gen kodiert die Cytidindesaminase (CDD), ein zinkabhängiges Enzym, das die Desaminierung von Cytidin und Desoxycytidin zu Uridin bzw. Desoxyuridin katalysiert und damit den Pyrimidin‑Salvage‑Stoffwechsel sowie die Nukleosid‑Homöostase unterstützt. Durch die Regulation intrazellulärer Nukleosidpools beeinflusst CDD die Kapazität für DNA‑Replikation und -Reparatur und kann über metabolische Inaktivierung zelluläre Reaktionen auf die Exposition gegenüber Nukleosidanaloga modulieren. Die CDA‑Aktivität ist in breitere Netzwerke des Nukleotidstoffwechsels eingebunden, die Proliferation, die Toleranz gegenüber Replikationsstress und das mitochondriale–nukleäre Gleichgewicht der dNTP‑Verfügbarkeit prägen. Eine fehlregulierte Expression oder Aktivität von CDA/CDD wurde mit veränderten Phänotypen des Nukleosidstoffwechsels in Zusammenhang gebracht, die für die Krebsbiologie, die Funktion von Immunzellen und vererbte Variationen in Arzneistoff‑Metabolisierungswegen relevant sind, was CDA zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien macht.

CDD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CDA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CDD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CDA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CDA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CDD-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CDA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CDD-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CDD-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CDA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.