CD39 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-419549-ACT

Entpd1 kodiert CD39 (Ecto-Nukleosidtriphosphat-Diphosphohydrolase-1), eine an der Zelloberfläche lokalisierte Ectonukleotidase, die extrazelluläres ATP und ADP zu AMP hydrolysiert und damit die purinerge Signalübertragung sowie nukleotidgetriebene Entzündungsprozesse prägt. Durch die Kontrolle der Verfügbarkeit von ATP/ADP für die Aktivierung von P2-Rezeptoren und durch die Bereitstellung von Substrat für die CD73-abhängige Adenosinproduktion reguliert CD39 die Aktivierung von Immunzellen, die Thrombozytenfunktion und Endothelreaktionen. In Mausmodellen wird die CD39-Aktivität häufig im Zusammenhang mit vaskulärer Entzündung, Thromboseregulation und immunregulatorischen Schaltkreisen untersucht, die Gewebeschädigung und tumorassoziierte Immunsuppression beeinflussen. Eine veränderte ENTPD1/CD39-Expression wird zudem mit chronischen Entzündungszuständen in Verbindung gebracht, bei denen der extrazelluläre Nukleotidstoffwechsel die Rekrutierung von Leukozyten und die Zytokinsignalgebung beeinflusst.

CD39 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Entpd1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CD39 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Entpd1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Entpd1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CD39-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Entpd1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CD39-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CD39-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Entpd1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.