Plasmide CRISPR d'Activation (m) CCK-4: sc-427959-ACT

Le gène murin Ptk7 code la protéine tyrosine kinase 7 (également appelée CCK-4), un récepteur atypique du réseau Wnt/planar cell polarity (PCP) qui contribue à coordonner la migration cellulaire directionnelle, la polarité tissulaire et les mouvements morphogénétiques. PTK7 module la signalisation Wnt non canonique via des interactions avec les composants centraux de la PCP, influençant le remodelage du cytosquelette, l’adhésion cellulaire et le comportement collectif des cellules au cours du développement. Une expression ou une signalisation de PTK7 dérégulée a été associée, dans des modèles de cancer, à des phénotypes d’invasion et de métastase altérés, ainsi qu’à des défauts de développement du tube neural et du système cardiovasculaire dans des études génétiques. En tant que régulateur de signalisation associé à la surface cellulaire, PTK7 est fréquemment utilisé pour étudier les interactions entre les voies Wnt/PCP, la signalisation des récepteurs et les programmes transcriptionnels dépendants de la polarité.

CCK-4 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Ptk7 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CCK-4 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Ptk7 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Ptk7, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CCK-4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Ptk7 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CCK-4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CCK-4 dans les cellules tumorales présentant une expression de Ptk7 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.